Prof. Giovanni Alei - Attività di Ricerca
• Concentrazioni di acido ossolinico in campioni di liquido seminale umano
INTRODUZIONE.

La difficoltà del trattamento medico delle prostatiti, che sono frequentemente implicate nelle infezioni recidivanti dell'apparato urinario, è dovuta principalmente alla scarsa concentrazione di antibiotici e chemioterapici ottenibile nel liquido prostatico. La diffusione e la concentrazione attraverso l'epitelio prostatico sono ottimali soltanto per farmaci liposolubili, a basso grado di ionizzazione nel plasma, scarsamente legati alle proteine plasmatiche. Inoltre, dal momento che le secrezioni prostatiche sono debolmente acide (pH 6,4 - 6,6), risultano più efficaci, ai fini terapeutici, sostanze basiche attive in forma ionizzata. I chemioterapici che possiedono tutte o alcune di queste caratteristiche non sono molti: tra quelli che raggiungono concentrazioni terapeutiche in prostata i più diffusi sono l'oleandomicina, la doxyciclina, l'eritromicina, il trimethoprim, l'acido pipemidico e l'acido nalidixico: tuttavia, non sempre questi composti sono in grado di esplicare al massimo la loro attività antibatterica nel liquido prostatico.

Tra i chemioterapici già sperimentati nel trattamento di infezioni urinarie, l'acido ossolinico presenta caratteristiche chimico-fisiche che fanno presupporre una buona diffusibilità attraverso l'epitelio prostatico: è infatti liposolubile, legato per il 70% circa alle proteine plasmatiche e dotato di una debole basicità dovuta all'azoto dell'anello.(`) Poiché questo chemioterapico dimostra attività battericida verso la maggior parte delle specie batteriche responsabili dei casi di prostatite, ci è sembrato utile verificarne la concentrazione nel liquido prostatico; a causa però dell'esigua quantità di secreto ottenibile con la spremitura di prostate sane, i dosaggi sono stati effettuati su campioni di liquido seminale, in cui, come è noto, è presente una componente secretoria prostatica variabile dal 13 al 32%.(12)

MATERIALI E METODI.

Il dosaggio microbiologico dell'acido ossolinico è stato eseguito su 20 campioni di liquido seminale di altrettanti pazienti volontari con patologie non infiammatorie né batteriche dell'apparato urogenitale. Questi pazienti, pervenuti all'ambulatorio andrologico della Clinica Urologica dell'Università di Roma, avevano un'età compresa tra i 19 e i 40 anni (età media: 32,2 anni). Cinque dei soggetti presentavano azoospermia secretoria essenziale; undici oligoastenozoospermia da varicocele sinistro; quattro oligoastenozoospermia da varicocele bilaterale. Dopo somministrazione del chemioterapico* alle dosi di una compressa da 750 mg per os ogni 12 h per sette giorni consecutivi veniva raccolto un campione di liquido seminale al mattino del settimo giorno di terapia.

Determinazione quantitativa dell'acido ossolinico in campioni di liquido seminale. Per il dosaggio dell'acido ossolinico nei campioni esaminati è stato impiegato il metodo dei pozzetti in agar. Microorganismo test: E. coli JG 184 (rha lacY 14 rpsl rec A 56) proveniente dalla collezione di G. P. Tocchini Valentini.

Terreno di mantenimento del germe: Muller Hinton Agar.

Terreno per precoltura: Antibiotic Medium 3.

Terreno per l'esecuzione del dosaggio: a) strato profondo: Antibiotic

Medium 2 addizionato di Agar Noble (DIFCO) in quantità pari al 5%;

b) strato superficiale: Antibiotic Medium 2.

Prova preliminare per la sensibilità alla spermina: E. coli JG 184 è stato saggiato per questo carattere seguendo la tecnica consigliata da FAIR e coll. La resistenza dimostrata lo rende adatto ad essere impiegato come ceppo test in titolazioni microbiologiche di agenti antibatterici in campioni di liquido seminale.

Preparazione dell'inoculo: il germe veniva seminato in Antibiotic Medium 3 e coltivato per 18-24 h a 37`C; 0,1 ml di questa brodocoltura venivano seminati in 5 ml dello stesso terreno e tenuti in termostato per 4 h a 37°C. Alla fine di tale periodo si otteneva una precoltura di D.O. pari a quella del n. i della scala nefelometrica di McFarland.

Preparazione delle piastre: 30 ml del terreno per strato profondo venivano versati in una capsula Petri di 12 cm di diametro alta 1 cm circa e lasciati solidificare su una superficie perfettamente piana. Successivamente si procedeva alla preparazione dello strato superficiale, inoculando con 0,1 ml di precoltura 15 ml di Antibiotic Medium 2 sciolto e mantenuto alla temperatura di 45°C. Tale strato superficiale veniva versato nelle piastre sopra lo strato profondo e lasciato solidificare. A completo raffreddamento venivano scavati 9 pozzetti di 7 mm di diametro nello spessore dell'agar.

Soluzione standard dell'acido ossolinico: veniva preparato in soluzione fisiologica sterile solubilizzando il farmaco con NaOH 0,1 N. La concentrazione finale della soluzione così preparata era di 200 mcg/ml; il pH raggiunto di 7,8.

Determinazione della curva standard dell'acido ossolinico: dalla soluzione standard di acido ossolinico (200 mcg/ml) venivano preparate diluizioni scalari che, aggiunte al liquido seminale (pool di campioni non trattati) in rapporto di 0,1/0,9 ml, davano luogo a concentrazioni finali pari a 0,5;1;2;4;8;16 mcg/ml. Le diluizioni venivano inoculate nei pozzetti (quattro volte ciascuna) in volume di 0,1 ml. Le piastre, dopo i h di permanenza a 4°C, venivano poste in termostato a 37°C per 18 h. Alla fine di questo periodo si procedeva alla lettura degli aloni di inibizione; il limite inferiore di lettura con il ceppo impiegato era di 0,5 mcg/ml.

FIG. 1. - Retta standard di acido ossolinico. Ceppo test: E. coli JG 184.

La retta standard veniva definita ponendo in ascisse il logaritmo della concentrazione e in ordinate il valore medio dei diametri degli aloni di inibizione. L'equazione della retta di perequazione è stata calcolata secondo le formule riportate da CAVALLI-SFORZA

Determinazione delle concentrazioni di acido ossolinico presenti nel liquido seminale: i campioni da esaminare venivano distribuiti nei pozzetti, con una micropipetta Oxford Sampler, in volume di 0,1 ml senza essere diluiti. Ciascun campione veniva saggiato 4 volte. Per ogni titolazione alcuni pozzetti per piastra erano riservati a tre diluizioni (0,5; 2; 8 mcg/ml) di acido ossolinico (preparate come per la curva standard) per verificare la corrispondenza con la retta standard. L'incubazione delle piastre e l'interpretazione dei diametri di inibizione venivano effettuate secondo le modalità precedentemente descritte.

RISULTATI E CONCLUSIONI.

I risultati sono esposti nella figura 1 e nella tabella I. Nella figura 1 è tracciata la curva standard dell'acido ossolinico, costruita in base all'equazione y = 12,2+8,9x.

TABELLA 1

CONCENTRAZIONI DI ACIDO OSSOLINICO
RISCONTRATE IN 20 CAMPIONI DI LIQUIDO SEMINALE

Paziente

Età

Patologia

Acido ossolinico (mcg/ml)

T.M.

30

Azoospermia secretoria essenziale

5,90

L.V.

36

»

1,70

V.R.

32

»

1,90

A.M.

21

»

3,95

C.T.

39

»

1,50

T.A.

28

Oligoastenozoospermia da varicocele sinistro

0,65

M.C.

38

»

1,35

V.A.

39

»

0,85

D.B.C.

32

»

3,50

R.F.

38

»

0,65

G.V.

19

»

7,90

T.A.

34

»

2,10

C.C.

40

»

1,00

G.A.

25

»

0,65

F.B.

20

»

3,20

A.G.

35

»

4,25

C.S.

36

Oligoastenozoospermia da varicocele bilaterale

2,55

S.P.

30

»

1,00

F.R.

35

»

1,50

I.F.

37

»

1,70

Nella tabella I sono riportati i tassi di acido ossolinico (in mcg/ml) presenti nel liquido seminale di 20 soggetti volontari esenti da patologie infiammatorie o batteriche dell'apparato urogenitale. I valori osservati oscillano da un minimo di 0,65 mcg/ml ad un massimo di 7,9 mcg/ml. Il valore medio, calcolato su queste venti osservazioni, corrisponde a 2,39 mcg/ml; i limiti fiduciali della media sono compresi, per P = 99%, tra 1,16 e 3,62 mcg/ml (2,39 ± 1,23) e sono stati calcolati secondo le formule riportate dal CAVALLI-SFORZA. Il valore medio reale di acido ossolinico presente per ml di liquido seminale nella popolazione rappresentata dal nostro campionamento, quindi, si trova compreso in questo intervallo. Altri autori, studiando l'attività antibatterica dell'acido ossolinico, hanno potuto osservare valori di M.I.C. al 50% e al 90% nei confronti di diverse specie batteriche, tali da essere minori del limite fiduciale inferiore della media calcolata sui 20 soggetti esaminati.

Come già accennato, la titolazione è stata eseguita su campioni di liquido seminale per l'impossibilità di ottenere liquido prostatico da prostate sane in quantità sufficiente per un dosaggio corretto. Ciò comporta che i valori da noi osservati potrebbero risultare inferiori a quelli realmente raggiungibili in prostata; la percentuale di liquido prostatico presente nel liquido seminale infatti varia dal 13 al 32%.(12) Da quanto detto si può dedurre che l'acido ossolinico potrebbe essere di utile impiego nel trattamento di prostatiti dovute a microorganismi sensibili a questo chemioterapico.

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